摘要：目的确定指标权重系数，建立乌甘袋泡茶饮片最佳提取工艺并进行抗炎机制研究。方法比较层次分析法（AHP）、基于指标相关性的权重确定方法（CRITIC）、AHP-CRITIC混合加权法确定权重系数，对正交试验结果进行综合得分比较，优选乌甘袋泡茶饮片提取工艺。通过HE染色观察大鼠咽部黏膜病理变化，测定血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量变化探讨抗炎作用。结果AHP-CRITIC混合加权法科学优选出最佳煎煮工艺参数为饮片浸泡30min，第1次加7倍量水煎煮45min；第2、3次加6倍量水煎煮30min，浓缩至饮片质量5倍量。乌甘袋泡茶高、中剂量组可以改善咽部黏膜组织病变，可以降低L-1β、IL-6β、TNF-α含量。结论通过AHP-CRITIC混合加权法正交试验优选的乌甘袋泡茶饮片提取工艺稳定。此工艺条件下的饮片提取液继续浓缩制备的乌甘袋泡茶对大鼠慢性咽炎有一定的治疗作用，通过降低炎症因子发挥药效。
慢性咽炎（chronicpharyngitis）为咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织的慢性炎症，病程长，症状顽固[1]，不易治愈，严重影响患者的正常生活。目前，对于慢性咽炎的治疗有中药与化学药2种方式，但分别存在起效长、价格昂贵、服用不便及不同程度副作用问题。乌甘袋泡茶是以张仲景《伤寒论》中“桔梗汤”为基础，加味乌梅、绞股蓝、绿茶，乌梅、桔梗、甘草、绞股蓝、绿茶以2∶1∶1∶1∶1配方而成。乌梅药量加倍，敛肺止咳，为方中君药；桔梗利咽排脓，为臣药；甘草祛痰止咳，同时调和诸药，为佐药；绞股蓝可消炎止咳，绿茶可清热降火，同为使药；绞股蓝、绿茶发挥袋泡茶载体作用，将饮片提取液的浓缩液与载体混合均匀，做成袋泡茶剂型。方中所用药材均为“药食同源”类，安全无毒副作用。同时现代实验研究证实所用药材均对咽炎有一定作用。其复方中总皂苷成分对多种非特异性炎症有明显抗炎作用；甘草酸[2-3]、甘草次酸[4]是镇咳祛痰的主要有效成分；桔梗有祛痰[5-6]、抗炎作用[7]，乌梅中有机酸有抗炎作用[8]，可协同作用于慢性咽炎辅助治疗。
但因中药化学成分较多，煎煮时多种化学成分相互影响，无法准确判断各有效成分对总体药效的贡献率。层次分析法（AHP）[9]是将人的主观判断用数量形式处理以计算各指标权重，但主观计算权重系数存在误差，缺乏科学性指导。基于指标相关性的权重确定方法（CRITIC）[10]是采用数学分析方法对多个指标进行客观赋权体现权重，科学严谨，但不能体现中药复方主治功效及组方比列的特点。故本研究将AHP、CRITIC2种方法结合即AHP-CRIRIC混合加权法评价正交试验，既注重客观，又不失主观，评价结果更加科学、合理。同时，对乌甘袋泡茶治疗慢性咽炎的抗炎作用进行研究，为患者提供一个安全有效的辅助治疗慢性咽炎的药物。
1仪器与材料
1.1仪器
Waters高效液相色谱仪、Waters二极管阵列检测器，美国Waters公司；AUY型电子分析天平，日本Shimadzu公司；徕卡-转轮式切片机，德国Leica公司；TSJ-II型全自动封闭式组织脱水机，常州市中威电子仪器有限公司；BMJ-III型包埋机，常州郊区中威电子仪器厂；PHY-III型病理组织漂烘仪，常州郊区中威电子仪器厂；BADigital数码三目摄像显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司。
1.2材料
对照品枸橼酸（批号CHB）、绿原酸（批号CHB），均购自于成都克洛玛生物科技有限公司；对照品甘草苷（批号wkq）、桔梗皂苷D（批号wkq）、甘草酸铵（批号wkq）均购自于四川省维克奇生物科技有限公司；各对照品质量分数均≥98%；白细胞介素-1β（IL-1β，批号21I）、IL-6β（批号21I）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号21I）ELISA（96T）试剂盒购自依科赛生物制品有限公司；慢严舒柠咽炎片（批号Z），西安科力药业有限公司。乌梅、桔梗、甘草均购自成都荷花池中药材批发市场，经宋良科副教授鉴定分别为乌梅来源于蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.etZucc.的干燥近成熟果实；桔梗来源于桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根；甘草来源于豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎[11]。
1.3动物
SPF级大鼠48只，雄性，体质量～g，购自成都达硕实验动物公司，生产许可证号SCXK（川）-24。
2方法与结果
2.1乌甘袋泡茶生产工艺流程
乌甘袋泡茶由乌梅、桔梗、甘草、绞股蓝、绿茶按照2∶1∶1∶1∶1配方而成。按照比例取乌梅、甘草、桔梗饮片适量于圆底烧瓶，饮片加适量水浸泡后，回流提取一定时间，趁热滤过，合并提取液并浓缩，浓缩液与绞股蓝、绿茶粗粉（50目）混合均匀，60℃干燥4h，灭菌，分装，即得。
2.2色谱条件
采用KromstarTMC18（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10min，3%乙腈；10～25min，3%～12%乙腈；25～40min，12%～15%乙腈；40～41min，15%～19%乙腈；41～55min，19%～30%乙腈；55～56min，30%～19%乙腈；56～95min，19%～50%乙腈；进样量10μL；体积流量0.6mL/min；柱温35℃；枸橼酸、绿原酸、桔梗皂苷D检测波长为nm，甘草苷、甘草酸检测波长为nm。
2.3溶液的制备
2.3.1混合对照品溶液的制备精密称取枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸铵对照品适量于量瓶，加50%乙醇溶解，得各对照品储备液，分别移取适量储备液混合，得混合对照品溶液（枸橼酸.0mg/L、绿原酸24.0mg/L、甘草苷.2mg/L、桔梗皂苷D.8mg/L、甘草酸.7mg/L（甘草酸质量＝甘草酸铵质量/1.），按“2.2”项色谱条件进样，记录色谱图，见图1。
2.3.2供试品溶液制备称取乌梅50g于圆底烧瓶，甘草、桔梗饮片各25g于圆底烧瓶，饮片加入一定料液比的水浸泡后，回流提取一定时间，趁热滤过，合并一定次数提取液，减压浓缩至饮片质量5倍量，得饮片提取液。取饮片提取液1mL，50%乙醇定容至10mL，超声（W）45min，得供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样，记录色谱图，见图2。
2.3.3阴性供试品溶液制备取乌甘袋泡茶配方与比例下饮片，按照“2.3.2”项供试品溶液制备方法，分别提取缺乌梅、缺桔梗、缺甘草共3份阴性提取液，取阴性提取液1mL，50%乙醇定容至10mL，超声（W）45min，得阴性供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样分析，记录色谱图，见图3。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系考察精密吸取“2.3.1”项混合对照品溶液分别稀释2、3、4、6、12、30倍，进样10μL，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸的线性回归方程分别为Y1＝X－（r21＝0.），Y2＝X＋（r22＝0.），Y3＝37595X－（r23＝0.），Y4＝X－（r24＝0.），Y5＝X－16（r25＝0.），分别在.8～.0、0.8～24.0、5.0～.2、3.4～.8、3.4～.7mg/L内线性关系良好。
2.4.2专属性考察按照“2.2”项色谱条件，测定50%乙醇空白溶剂和“2.3.3”项阴性供试品溶液，记录色谱图，相关色谱图如图1和图3所示，空白、阴性均无明显干扰，该色谱方法专属性良好。从阴性供试品色谱图可知，1、2号峰（枸橼酸、绿原酸）来自乌梅，3、5号峰（甘草苷、甘草酸）来自甘草，4号峰（桔梗皂苷D）来自桔梗。
2.4.3精密度试验精密吸取上述混合对照品溶液，按照“2.2”项色谱条件，进样6次，枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸峰面积的RSD分别为0.63%、0.22%、0.10%、1.88%、1.14%，表明仪器精密度良好。
2.4.4稳定性试验取同一批次饮片提取液供试品溶液分别放置0、2、4、8、12、24h，按照“2.2”项色谱条件进样，在24h内枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸峰面积RSD分别为0.34%、2.34%、0.57%、1.19%、0.48%，表明供试品溶液24h内稳定性良好。
2.4.5重复性试验取同一批饮片，平行制备6批饮片提取液供试品溶液，按照“2.2”项色谱条件进样，枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸质量分数RSD分别为0.43%、2.42%、0.50%、1.12%、0.48%，表明该方法重复性良好。
2.4.6加样回收率试验取已知含量的饮片提取液供试品溶液0.5mL，精密加入等量对照品储备液，平行制备6批供试品溶液，按照“2.2”项色谱条件进样，枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸的平均加样回收率分别为99.24%、.61%、98.48%、97.23%、97.91%，RSD分别为3.29%、0.78%、3.69%、2.36%、1.84%，表明该实验方法准确可靠。
2.5出膏率测定
精密移取饮片提取液10mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干移至℃烘箱3h，取出，置干燥器冷却30min，称定质量，计算出膏率[12]［出膏率＝(M1－M0)/m，M1为干膏与蒸发皿总质量，M0为空蒸发皿总质量，m为提取药材质量］。
2.6正交试验设计
2.6.1考察指标的选择在《中国药典》年版[11]中乌梅含量检测指标是枸橼酸，桔梗含量检测指标是桔梗皂苷D，甘草含量检测指标是甘草酸和甘草苷。且参照文献报道[2,4-5,7-8]上述成分均是饮片提取液镇咳祛痰、抗炎的药效成分，故以枸橼酸（X1）、绿原酸（X2）、甘草苷（X3）、桔梗皂苷D（X4）、甘草酸（X5）的提取率及饮片提取液出膏率（Y）为量化考察指标。
提取率＝提取液中成分提取质量/提取药材质量
2.6.2正交因素选择及设计通过前期单因素试验结果，确立了以第1次提取时间（A）、浸泡时间（B）、加水倍量（C）、提取次数（D）4因素3水平L9(34)正交试验，正交因素水平见表1。按照处方中乌梅、甘草、桔梗比例，称取各饮片适量，回流提取，合并提取液减压浓缩至饮片5倍量，得饮片提取液。
2.7综合评分计算方法的选择
2.7.1AHP法确定综合评分权重系数AHP法是根据指标成对比较的优先判断矩阵方法。根据实验所用乌甘茶处方中药味剂量比及各药味中特征成分含量的多少，将各个指标进行量化，分为5个层次，其优先顺序为枸橼酸提取率（X1）＞甘草酸提取率（X5）＝甘草苷提取率（X3）＞桔梗皂苷D提取率（X4）＞绿原酸提取率（X2）＞出膏率（Y），判断矩阵评分表[13]见表2。经AHP层次研究确定枸橼酸、绿原酸、甘草苷、桔梗皂苷D、甘草酸、出膏率权重系数分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.。一致性比列因子（CR）＝0.＜0.10，即指标优先比较判断矩阵具有一致性，权重系数有效。
2.7.2CRIRIC法确定权重系数CRIRIC法是以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础，通过标准差的形式将对比强度体现出来，指标间的相关性将冲突性体现出来，是一种能客观反映指标权重的计算方法。将数据经线性插值进行标准化处理［指标成分＝(实测值－最小值)/(最大值－最小值）］[14]，根据SPSS20.0软件处理数据得（6×6）相关系数矩阵（A）。由Cj、Wj[15]公式得各特征性成分及出膏率权重系数分别为0.1、0.、0.、0.、0.3、0.1。
Cj表示第j个指标所包含的信息量，δj表示标准化后列向量的标准差，rij表示i与j之间的相关系数，Wj表示第j个指标的客观权重
2.7.3AHP-CRIRIC混合加权法确定权重系数CRITIC法相对于AHP法能更客观评价相应指标的权重系数，将2种方法结合计算综合权重，即ωAHP-CRITIC＝ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij[14]，AHP-CRITIC法计算各特征性成分及出膏率权重系数分别为0.、0.、0.、0.、0.6、0.。
2.7.43种评分结果比较及综合评分公式确立选用上述3种评分系数分别对正交试验结果综合评分，各方法得分见表3。
采用SPSS20.0统计软件对3种评分结果的分数进行相关系数分析。AHP法与AHP-CRITIC法的得分相关系数为1.，CRITIC法与AHP-CRITIC法的得分相关系数为0.，AHP法与CRITIC法的得分相关系数为0.，3者相关性显著（P＜0.05）。AHP法与CRITIC法权重系数的相关系数为0.，相关性不显著（P＝0.），说明2种方法所反映的信息不具有叠加性，AHP-CRITIC混合加权法从主、客观2方面考虑，所体现的信息更为科学合理，故选择AHP-CRITIC法来计算综合评分（Z）。
Z＝(0.X1/X1max＋0.X2/X2max＋0.X3/X3max＋0.X4/X4max＋0.6X5/X5max＋0.Y/Ymax)×
2.8正交试验结果
2.8.1提取工艺确立乌甘袋泡茶的饮片回流提取L9(34)正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。
由表4可得A3B2C1D3为最佳提取工艺提提条件，即加水7倍量饮片浸泡30min，第1次提取60min，第2、3次分别加6倍水，提取30min，合并3次提取液，减压浓缩至饮片质量5倍量。
由表5可知，A（提取时间）对各成分提取无显著影响，为节约工业生产时间成本与能源，选择缩短提取时间至45min。最佳工艺确定A2B2C1D3即饮片加7倍量水浸泡30min，第1次提取45min；第2、3次均加6倍量水提取30min；合并3次煎液后减压浓缩至饮片质量5倍量，得饮片提取液。
2.8.2验证实验为验证正交试验结果的准确性，保证乌甘茶袋泡茶饮片提取工艺的合理可靠，按正交试验选出A2B2C1D3工艺进行3次重复性验证实验。验证结果见表6。结果表明，各成分提取率RSD均在3%以内，表明A2B2C1D3提取工艺稳定，可用于下一步研究。
2.9药效学研究
慢性咽炎的发生可能与急性咽炎多次复发、上呼吸道慢性炎症或长期受物理化学刺激、用嗓过度有关。本实验所用2.5%氨水喷咽部造模，模拟长期受化学刺激因素所引发的慢性咽炎模型。长时间低浓度氨水刺激，可造成咽部红肿，形成炎症[16]。通过HE病理切片观察咽部黏膜下组织可直观反映模型是否成功，乌甘袋泡茶是否有效。生化指标IL-1β、IL-6β、TNF-α的检测可间接反映药效。IL-1β是一种主要由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子，是导致炎症的一种重要因子。炎症的良好生物标志物是C-反应蛋白（CRP），其主要依赖于IL-6的表达。TNF-α能使毛细血管通透性增加，刺激淋巴细胞增殖和分化，导致炎症反应和组织损伤[17]。当炎症发生，炎症因子浓度会增加，故以2.5%氨水长时间刺激造模，检测IL-1β、IL-6β、TNF-α[18]指标进行实验研究。
2.9.1慢性咽炎模型的建立及给药按照正交试验优选出饮片最佳提取工艺A2B2C1D3，进行10倍放大实验研究。取放大实验饮片提取液继续减压浓缩（?0.08MPa，58℃）至适量，与绞股蓝、绿茶粗粉混合，干燥，得乌甘袋泡茶。参照文献方法[19]给药，同时根据《中国药典》年版一部中乌梅、桔梗、甘草推荐每日服用量，乌甘袋泡茶（批次）推荐成人每日服用量为8.0g，（按70kg体质量计）。取乌甘袋泡茶适量，加10倍量水回流提取2次，减压浓缩至0.g/mL，实验前用蒸馏水分别稀释2倍和3倍。乌甘袋泡茶低、中、高剂量（0.36、0.72、1.14g/kg）分别为正常量的0.5、1、2倍。取规格为0.25g/片的慢严舒柠咽炎片适量，临用研磨成粉，精密称定，给药剂量0.34g/kg，作为阳性药，空白组给予等容积蒸馏水。大鼠适应性喂养1周，随机将SD大鼠分为空白组、模型组、慢严舒柠咽炎片阳性药组及乌甘袋泡茶高、中、低剂量组，每组各8只。取8只做为空白组，其余大鼠固定后用镊子拉出鼠舌，用止血钳压住并撬开口，暴露咽部，使用喉头喷雾器给予2.5%氨水喷咽部造模，每日上、下午各1次，每次3揿[20-21]，空白组同法，用蒸馏水喷咽部，连续15d。造模后第16天起，每日早晚各ig给药1次，给药容积为0.01mL/g，连续给药7d。
2.9.2咽部病理学观察ig给药7d后，大鼠股动脉取血（静置30min，待凝固后，4℃，3r/min离心15min，分离上层血清置2mL离心管中，密封，?80℃冷冻保存，4d内测定），取血后立即断头，取咽部黏膜组织，10%甲醛液中固定24h后，取材，常规脱水，石蜡包埋，切片，用HE染色后于光镜下观察，结果见图4。
由图4结果分析，模型组大鼠黏膜上皮增生、固有层腺上皮细胞变性、轻微出血、炎细胞浸润和纤维增生等病理改变，说明动物慢性咽炎模型造模成功。空白组和乌甘袋泡茶高剂量组未见明显病理变化；阳性药组黏膜上皮层结构较完整，结缔组织内见少量纤维组织增生和中性粒细胞浸润；乌甘袋泡茶中剂量组有黏膜上皮增生现象；低剂量组局部固有层内较多炎细胞浸润并伴有少量纤维组织增生现象。与模型组相比，乌甘袋泡茶各剂量组对大鼠咽部黏膜损伤均有不同程度改善，其中高剂量药效优于阳性药组，低剂量效果不明显，说明乌甘袋泡茶对慢性咽炎有一定改善作用，可用于对慢性咽炎的辅助治疗。
2.9.3IL-1β、IL-6β、TNF-α水平检测将?80℃冷冻保存的各组血清置室温下复融，3r/min离心5min，吸取血清，置1mL离心管中，采用ELISA法分别测定血清中IL-1β、IL-6β、TNF-α，按照试剂盒说明操作。结果见表7。
统计学处理用SPSS20.0统计软件分析数据，结果用表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
由表7分析，与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6β、TNF-α浓度均明显增加，呈显著性差异（P＜0.05）说明咽部有一定程度炎症，大鼠慢性咽炎模型造模成功。与模型组相比，乌甘袋泡茶高剂量组血清中IL-1β、IL-6β、TNF-α浓度显著降低（P＜0.05），IL-1β、TNF-α浓度与阳性药组接近，药效与阳性药组接近。中剂量组IL-1β、IL-6β与模型组有显著性差异（P＜0.05）。低剂量组除IL-6β与模型组呈显著性差异（P＜0.05）外，其他炎症因子与模型组并无差异性，综合考虑说明，乌甘袋泡茶低剂量对慢性咽炎的治疗效果欠佳。乌甘袋泡茶中、高剂量均对慢性咽炎有一定治疗作用，以高剂量药效最佳，通过降低或抑制血清中炎症因子浓度，改善慢性咽炎病症。
3讨论
乌甘袋泡茶以经典方“桔梗汤”为基础，疗效确切，加味乌梅进行药效成分提取，加味绞股蓝、绿茶粗粉做成袋泡茶剂型，解决传统中药汤剂服用不方便的问题。研究中为保证乌甘袋泡茶提取工艺稳定性，实验以多种特征成分提取率及出膏率为考察指标，为避免工艺研究中主观赋予指标权重缺乏科学性的问题，采用主观评分结合科学分析的AHP-CRIRIC混合加权法确定多指标权重系数，确定最佳提取工艺。通过氨水刺激建立慢性咽炎模型，观察咽部黏膜病理切片及检测相关炎症因子水平，证明乌甘袋泡茶对慢性咽炎有一定治疗作用，期望可为患者提供一个安全、有效可长期服用的辅助治疗方式。
实验中乌甘袋泡茶提取工艺稳定，但在实际工业生产中饮片质量存在差异性，无法保证乌甘袋泡茶质量稳定。后续可研究饮片-提取液-乌甘袋泡茶中特征成分量值传递关系，确立特征成分的转移率及提取率范围，实现从饮片到成品质量可控，为其他中药制剂提供新的质量标准研究思路。
参考文献（略）
来源：张娇，蒋倩倩，张伯言，魏屹.基于AHP-CRITIC法正交优选乌甘袋泡茶提取工艺及抗炎作用研究[J].中草药,,51(8):-.
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